Дейвид Уилям Духовни е роден на 7 август 1960 г. в Ню Йорк. Майка му е шотландка, преподавала в училище в бедните части на Манхатън. Баща му, Амрам Духовни, роден в град Лвов, е автор на няколко книги. Родителите се развеждат, когато Дейвид е бил на 11 години. Завършва Принстън с магистърска степен по педагогика. Говори френски, латински и еврейски. Според колегите си той е един от най-интелигентните и начетени актьори.
Духовни прави дебют на големия екран с малка роля във филма на Майк Никълс "Работещо момиче през 1988 г. Придобива международна слава с ролята си в "Досиетата X". Сериалът дебютира по телевизионния канал "Fox" през 1993 година и проследява съдбите на специалните агенти на ФБР Фокс Мълдър и Дейна Скъли в опитите им да дадат отговор на необясними, често паранормални явления.
Двете роли – в "Досиетата X" и в "Секс до дупка" му носят "Златен Глобус".
Fox официално обявява, че поредицата "Досиетата Х" ще се завърне под формата на минисериал от шест епизода през 2016 г. Снимките ще започнат през лятото на 2015 г., а Дейвид Духовни и Джилиън Андерсън ще се върнат съответно към ролите си на Фокс Мълдър и Дейна Скъли. Премиерата ще се състои на 24 януари 2016 г.
През 1996 той е обявен за един от най-красивите хора на света според списание People, поставен на девето място.
Духовни се жени за актрисата Теа Леони на 6 май 1997 г. През 1999 г. им се ражда дъщеря - Мадлин, а второто им дете Кид - през 2002 г. Семеството живее в Малибу, Калифорния, докато двамата актьори се разделят през 2011 г.
